Tetraciclina 122

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Las proteínas ribosomales de protección y su mecanismo de protección de resistencia a la tetraciclina Ribosómica representa una táctica importante para la promoción de resistencia a la tetraciclina en ambas especies gram-positivos y negativos. Tet (O) y tet (M) son el mejor estudiado de estos determinantes y originalmente fueron aisladas de Campylobacter jejuni y Streptococcus spp. respectivamente, aunque ambos tienen una amplia distribución (10). Estos son los únicos dos proteínas de protección ribosomal (PPR) que han sido estudiados en detalle, y por lo tanto, han sido tratados ampliamente en esta revisión. Se supone, sin embargo, que los otros miembros de esta clase de los PRP Tet (S), Tet (T), Tet (Q), TetB (P), Tet (W), y la función de otra a través de mecanismos similares. La distribución de estos determinantes en la eubacterias ha sido ampliamente revisado por Chopra y Roberts (10) y la información más reciente también se puede encontrar en http://faculty. washington. edu/marilynr/. Aunque esta revisión se centra principalmente en los PRP, cabe señalar que una gran variedad de mecanismos de resistencia a la tetraciclina existe (para una revisión, véase la referencia 10). Estos determinantes incluyen (i) los mecanismos basados ​​en flujo de salida que se encuentran en las bacterias gram-positivas y gram-negativas (10), (ii) la degradación enzimática de las tetraciclinas que se encuentran en Bacteroides (46), (iii) las mutaciones de ARNr encuentra en Propionibacterium acnes y Helicobacter pylori (19. 40. 55), y (iv) una gran cantidad de mecanismos no determinados, que se parecen poco a los determinantes bien documentados mencionados anteriormente (10). En esta revisión, vamos a examinar los últimos avances en el estudio de los ribosomas, tetraciclina, y los PPR que promuevan la comprensión de la actividad RPP. A principios de trabajo que trata de Tet (M) y tet (O), así como el otro PRP ha sido revisado previamente (51. 52). Acciones inhibidoras de antibióticos de tetraciclina TETRACICLINAS. Tras su introducción en la medicina en 1948, tetraciclinas fueron rápidamente aceptadas, ya que ofrece un amplio espectro de actividad, ser activo frente a bacterias gram-positivos y negativos, y, más recientemente, se ha demostrado ser activo contra la clamidia, micoplasma, rickettsia, y algunos parásitos protozoarios (10). Las tetraciclinas pueden ser separados en dos grupos, las tetraciclinas atípicos (por ejemplo anhidrotetraciclina y 6-thiatetracycline) y tetraciclinas típicos (por ejemplo, tetraciclina, clortetraciclina, y minociclina) (9. 10. 35. 36. 38). Las tetraciclinas atípicos funcionan mediante la interrupción de las membranas bacterianas (36. 38). Alternativamente, las tetraciclinas típicos, que son el tema de la resistencia mediada por RPP, se unen al ribosoma e inhiben la fase de elongación de la síntesis de proteínas (8. 13). Más precisamente, inhiben alojamiento de aminoacil-tRNA (aa-tRNA) en el ribosomal Un sitio (Fig. 1. reacciones A y B) y, por lo tanto, evitar la adición de nuevos aminoácidos al polipéptido en crecimiento (22. 25. 29. 48). La vía de Tet (O) tetraciclina mediada por la liberación se ilustra mediante reconstrucciones crio-EM de los ribosomas en diferentes estados funcionales (2. 45). El ciclo de alargamiento natural está representado por las reacciones A a E, de tal manera que si el ribosoma está en el estado posttranslocational (POST), un complejo ternario de EF-Tu-aa-tRNA-GTP puede decodificar el codón presentado en el ARNm en el A sitio (reacción a). Después correcta interacción codón-anticodón, la actividad GTPasa de EF-Tu se activa y el aa-tRNA está alojado en el sitio A (b) de reacción, obteniéndose un ribosoma pretranslocational (PRE). Después de alojamiento, el grupo amino de la A aa-tRNA sitio enlazado ataca el enlace éster del destino a sitio P peptidil-ARNt, formando de este modo un enlace peptídico en una reacción llamada de transferencia peptidil (reacción c). Después de la formación del enlace peptídico, EF-G se une al ribosoma y promueve la translocación de los tRNAs de los sitios A y P a los sitios P ​​y E (reacciones d y e), completando así un ciclo único y devolver el ribosoma a un estado post . Tras la unión de tetraciclina (reacción f), el ribosoma supuestamente entra en un ciclo no productiva se ilustra por las reacciones i y j (4). En este ciclo, el complejo ternario intenta varias veces para unirse aa-ARNt al sitio A, pero falla. Tet (O) es capaz de rescatar el ribosoma de este ciclo no productiva mediante la liberación de tetraciclina a partir de su sitio de unión en la subunidad 30S (reacción g). Después de la promoción de la liberación de tetraciclina, tet (O) hidroliza su GTP unido y se disocia del ribosoma (reacción h), volviendo de este modo el ribosoma para el ciclo de elongación (reacciones A a E). Esta cifra se ha reproducido de las referencias 2 y 45 con permiso de los editores. Localización de sitios de unión a tetraciclina en el ribosoma. El efecto inhibidor de la tetraciclina en ocupación sitio se presume que está mediada por la unión a un sitio de alta afinidad única (K d 1 a 20 M) en la subunidad 30S ribosómica (20). Esto es significativo, ya que dos independiente 30S estructuras cristalinas subunidad tetraciclina muestran tetraciclina unido a cualquiera de dos (4) o seis sitios (37) en la subunidad 30S ribosomal (Fig. 2). Esto, por lo tanto, presenta un problema en la asignación de uno de los sitios determinados cristalográficamente al sitio inhibitorio biológicamente relevante. En el caso más sencillo, se podría esperar que este sitio es solo inhibitoria en estrecha proximidad a la ribosomal Un sitio, ya que es la unión al sitio que es inhibida por el fármaco aa-tRNA. A este respecto, la Tet-1 y el sitio primario en las estructuras Pioletti y Brodersen, respectivamente (Fig. 2), se encuentran en el ribosomal un sitio, donde la tetraciclina está obligado por el surco menor irregular de la hélice 34 (h34) y el bucle de la hélice 31 (H31) en el 16S rRNA (4. 37). En esta posición, se cree que la tetraciclina sería estéricamente interferir con aa-tRNA vinculante (4. 37). También es interesante que, en el sitio primario, tetraciclina hace interacciones casi exclusivamente con el esqueleto de fosfato de azúcar del ARN (4. 37). En este sentido, la falta de interacciones de base específica puede explicar la amplia especificidad de las tetraciclinas. (A) Las ubicaciones de los sitios determinados por Brodersen y col unión tetraciclina. (4) se muestran, en donde la tetraciclina ligado en el sitio primario es de color rojo (representación de la superficie) y la tetraciclina ligado en el sitio secundario es de color naranja. La estructura mostrada se deriva de la 3.4- modelo (PBD adhesión no. 1HNW). (B) Las ubicaciones de los sitios determinados por Pioletti y col unión tetraciclina. (37) se muestran, en donde la tetraciclina unido al sitio Tet-1 es de color rojo, tetraciclina unido al sitio Tet-2 es de color azul oscuro, tetraciclina unido al sitio Tet-3 es cian, tetraciclina unido al sitio Tet-4 se verde, tetraciclina unido al sitio Tet-5 es de color naranja, y la tetraciclina unido al sitio Tet-6 es de color púrpura. Nota, la numeración de los sitios de unión de tetraciclina refleja su ocupación relativa en el mapa de densidad electrónica. La estructura mostrada se deriva de la 4.5- modelo (PBD adhesión no. 1I97). Las interacciones de tetraciclina-ribosoma en el sitio Tet-1 son casi idénticos a que en el sitio primario, mientras que la pantalla sitio Tet-5 y secundaria interacciones distintas. Las cifras fueron preparadas con VMD (26) y PovRay (www. povray. org). Los sitios secundarios y Tet-5 de unión a tetraciclina (Fig. 2) también son candidatos probables para el sitio de unión inhibitoria (4. 37). Estos sitios de unión están asociados con la llamada hélice interruptor (h27) del 16S rRNA (28), aunque la naturaleza de sus interacciones con este hélice no son exactamente idénticos. En esta posición, la tetraciclina no puede interferir directamente con la unión ARNt, sino más bien, se podría ejercer su efecto inhibidor al interferir con la transición entre los estados abierto y cerrado de la subunidad ribosomal 30S, que es importante para la reacción de decodificación (34). Los otros cuatro sitios de unión a tetraciclina (Tet-2, -3, -4, -6 y) (Fig. 2B) observados por Pioletti et al. (37) no están correlacionados tan fácilmente con la acción inhibidora de la tetraciclina pero no explica los datos anteriores asociados con experimentos photolabeling (20. 33). El sitio de unión inhibidora. La determinación de cuál de los sitios de unión a tetraciclina mencionada representa el sitio inhibidor se ve facilitada por los datos que describen la naturaleza del sitio de inhibidor, la interacción de tetraciclina con el ribosoma, y ​​de los mecanismos que confieren resistencia a la tetraciclina. Por ejemplo, (i) el primario (y Tet-1) sitio es el sitio más altamente ocupado en ambas estructuras que muestran tetraciclina unido a la subunidad 30S (4. 37) consistente con la idea de que el sitio de alta afinidad es el sitio inhibidor (17. 47. 56). (Ii) en el primario (y Tet-1) sitio, varias interacciones de tetraciclina-ARN son mediados a través de un ion de magnesio, que se sabe que es importante para la unión de tetraciclina (4. 57). (Iii) Las estructuras cristalinas muestran que la cara de tetraciclina que interactúa con el rRNA en el primario (y Tet-1) sitio es también la cara donde modificaciones dan como resultado una pérdida de actividad biológica (4. 39). (Iv) química sondeo mostró que todos los derivados de tetraciclina que se unen al ribosoma e inhiben la síntesis de proteínas a mejorar la reactividad sulfato de dimetilo (DMS) de C1054 y U1052 en los rRNA 16S (asociado con el sitio de unión a tetraciclina primaria). En contraste, se encontró que sólo un subconjunto de estos derivados para proteger A892 (asociado con el sitio de unión de tetraciclina secundaria) de la modificación DMS (38). (V) 16S rRNA mutaciones visto en P. acnes (40) que confieren resistencia a la tetraciclina se encuentran en estrecha proximidad al sitio de unión primario H. pylori (19. 55) y. (Vi) Tet (O), un RPP que confiere resistencia a la tetraciclina, persigue tetraciclinas desde el sitio de unión primario pero no el sitio de unión secundario (12). mecanismo de acción propuesto tetraciclina. Brodersen et al. (4) postuló que con tetraciclina unido al sitio primario, el complejo ternario sería capaz de iniciar la decodificación, de manera que la interacción entre el codón y anticodón del destino a EF-Tu aa-tRNA no se vería afectada por la presencia de el fármaco (Fig. 1. i reacción). El siguiente paso implica la liberación del aa-tRNA de EF-Tu y su alojamiento en el sitio A sería, sin embargo, ser inhibida (Fig. 1. Reacción j), de tal manera que como el aa-tRNA gira en el sitio, el bucle anticodón del ARNt chocaría con tetraciclina (4. 37). Aunque la reacción de alojamiento se inhibe, la hidrólisis de GTP EF-Tu-dependiente no es (22), y por lo tanto, Brodersen et al. (4) especulan que un ciclo no productiva del complejo ternario de unión e hidrólisis de GTP y sin ocupación Un sitio sobrevendrá. Ribosomal PROTECCIÓN PROTEÍNAS PPR, como el Tet bien estudiado (O) y tet (M) (75 similitud de secuencias), son proteínas citoplásmicas solubles (72 kDa) que median la resistencia a la tetraciclina (51). Tet (O) se clonó primero a partir de un plásmido pUA466 transferible que se encuentra en el patógeno de origen alimentario C. jejuni (50). Sin embargo, el Tet (O), al igual que los otros PPR, parece haberse originado en el productor natural de oxitetraciclina, Streptomyces rimosus. que alberga Otra. un determinante RPP (16. 44. 49). En consecuencia, muchos de los determinantes RPP se encuentran en elementos genéticos móviles que puedan haber facilitado su propagación a través de las eubacterias a través de eventos de transferencia lateral de genes (revisado en referencia 10). Similitud entre los PRP y factores de elongación. El PRP secuencia de visualización similitud con los factores de elongación ribosomal, EF-G y EF-Tu (41), y se agrupan en la superfamilia de factor de traducción de GTPasas (27). En consecuencia, los PRP se unen y se hidrolizan GTP de una manera dependiente de ribosoma (5. 6. 53), y el mantenimiento de esta actividad es importante para la actividad in vivo (11. 23). Sánchez-Pescador et al. interpretado que esta similitud de secuencia para indicar que los RPPs funcionan como factores de elongación resistentes a la tetraciclina (41) sin embargo, Burdett (5. 6) mostró que Tet (M) no puede sustituir a los factores de elongación in vivo o in vitro. Sin embargo, el PRP se puede derivar evolutivamente de los factores de elongación, de manera que perdieron su función original y se han adaptado para funcionar en la resistencia a la tetraciclina. Protección de los ribosomas de la tetraciclina. Tet (O) y Tet (M) se pueden desprender tetraciclina del ribosoma (6. 54) y, de este modo, aumentar la constante de disociación aparente (K d) de unión al ribosoma de 5 tetraciclina a 30 M. La capacidad de Tet (O) y Tet (M) para desalojar la tetraciclina es estrictamente dependiente de la presencia de GTP (6. 54), aunque hay alguna discrepancia en cuanto a la función de la hidrólisis de GTP como un análogo de GTP no hidrolizable era activo con Tet (O) ( 54), pero sólo parcialmente activa con Tet (M) (6). Esto, sin embargo, probablemente no refleja una diferencia funcional, pero en cambio, puede ser el resultado de los diferentes métodos utilizados en cada laboratorio. De acuerdo con la capacidad de Tet (O) y Tet (M) para eliminar la tetraciclina, Burdett demostró que tRNA de unión al sitio A, que normalmente se inhibe por tetraciclina, es, de hecho, protegido en presencia de tet (M) (6). Por lo tanto, parece que Tet (O) y Tet (M) confieren resistencia a la tetraciclina mediante la liberación de la tetraciclina del ribosoma y liberando así el ribosoma de los efectos inhibitorios de la droga, de tal manera que aa-tRNA se puede unir a la síntesis de un sitio y proteínas puede continuar. El sitio de unión al ribosoma para los PRP. Gran parte del trabajo se ha hecho para definir el sitio de unión mediante el uso de ensayos bioquímicos (15), microscopía de criomicroscopía electrónica (crio-EM) (45), y el sondeo químico (11. 12). El sitio de unión se localiza primero al sitio de unión del factor de elongación cuando Dantley et al. (15) demostraron que Tet (M) y EF-G compiten por un sitio similar en el ribosoma. Además, los experimentos de Dantley et al. (15) sugirieron que un componente de este sitio común es la región L11 en la subunidad 50S. Esto se deriva del hecho de que la tioestreptona antibiótico, que se une esta región y, aparentemente, bloquea en él una conformación desfavorable para EF-G de unión (7), también inhibe la unión de Tet (M) (15). La interacción de Tet (O) con el ribosoma se estudió también por crio-EM, una técnica estructural que es capaz de generar modelos tridimensionales de complejos macromoleculares con una resolución de entre 10 y 30 (18). La final de 16 la reconstrucción en tres dimensiones de Tet (O) unido al ribosoma se puede ver en la Fig. 3A. donde se muestra una reconstrucción de un complejo de EF-G-ribosoma (Fig. 3B) para la comparación (1. 45). Notablemente, la densidad atribuida a Tet (O) en la reconstrucción de crio-EM tiene una forma general similar a la de EF-G (Fig. 3), de acuerdo con la similitud de secuencia se ha indicado anteriormente. También es evidente en la reconstrucción es que Tet (O) y EF-G son vinculantes a un sitio común situada en la interfase de la subunidad ribosomal en el lado de un sitio, en la base del tallo de L7 / L12 (Fig. 3), de acuerdo con Dantley et al. (15 ). reconstrucciones crio-EM de Tet (O) - GTPS (45) (a) y EF-G-GMPPCP (1) (b) ribosomal complejos. Se muestra el ribosoma (densidad azul) en la misma orientación como se ve en el inserto de la izquierda, donde la subunidad 30S es de color amarillo y la subunidad 50S es de color azul. Tet (O) y EF-G se muestran como densidades de color rojo. ribosomal puntos de referencia se indican. h, la cabeza CP, h38 central de la protuberancia, la hélice 38 de ARNr 23S SB, tallo de base sp, estimular sh, hombro b, cuerpo. Esta cifra se ha reproducido de la referencia 45 con permiso del editor. En el estudio de la crio-EM, Spahn et al. localizar los sitios de interacción entre Tet (O) y el ribosoma (Tabla 1), demostrando que que la mayoría de las interacciones son entre Tet (O) y el rRNA (45). La única excepción es una única interacción entre el dominio III de Tet (O) y la proteína ribosomal S12 (45). Además, una comparación de los EF-G y Tet contactos (O) ribosomal indica que difieren principalmente en la zona del dominio IV (Tabla 1), donde EF-G contactos H69 de los rRNA 23S (21. 45) y Tet ( O) interactúa con h18 / 34 de los rRNA 16S (45). Esto es significativo, ya que el dominio IV en EF-G ha sido implicado como un determinante importante para la promoción de la translocación de los tRNAs (30. 31. 42). En este caso, estas diferencias en el dominio IV pueden servir para distinguir Tet (O) y EF-G con respecto a sus actividades a saber, el dominio IV de EF-G se solapa más íntimamente con la A tRNA sitio de ruedas, una idea que es consistente con el papel del dominio IV de la EF-G en la translocación. Por el contrario, la interacción de dominio IV de Tet (O) y H34 de la subunidad 30S es consistente con su papel en la liberación de tetraciclina (45) porque h34 es un componente del sitio de unión de tetraciclina primaria (4. 37). EF-G y Tet (O) interacciones con el ribosoma un DMS, una sonda química que modifica la N1 y posiciones N3 de la adenosina y citosina, respectivamente, también se ha empleado para definir la interacción de Tet (O) con el ribosoma (12 ). En la subunidad 30S, los sitios de interacción se localizaron a h34 (C1214) y H44 (A1408), cerca del sitio de descodificación y el sitio de unión primario tetraciclina (Fig. 4). La protección de C1214 de la modificación DMS indicaría que esta base está protegido directamente por Tet (O), y esta conclusión está apoyada por el hecho de que el (O) sitio de unión Tet observado por crio-EM se acerca C1214 (Fig. 4B). La estrecha asociación de C1214 con el sitio de unión Tet (O) contrasta con la mejora de la A1408 por modificación DMS porque, como se ilustra en la Fig. 4B. Tet (O) no se aproxima A1408 en H44 (45). Por otra parte, una mejora de la modificación química es claramente indicativo de un cambio conformacional, por lo tanto, este resultado se puede interpretar como una señal de que el Tet (O) es la inducción de reordenamientos de largo alcance en el ribosoma. Estos cambios podrían estar mediados por S12, que está en las proximidades de la parte superior de h44 (43. 58) y también parece interactuar con Tet (O) (45). bases de ARNr que son alterados en la modificación de DMS por la unión de Tet (O) se agrupan alrededor del centro de la decodificación. (A) Tet (O) (densidad rojo) (45) unido a la subunidad 30S (58) (PDB código de identificación 1FJF) en las mismas orientaciones como se ve en el panel B. hélices 31 (nucleótidos 964 a 968), 34 (nucleótidos 1199-1217 y 1058-1046) y 44 (nucleótidos 1400 a 1414 y 1486 a 1503) están representados como cintas de amarillo, azul y rojo, respectivamente, y el rRNA restante se representa como una cinta gris. (B) Interacción de dominio IV de Tet (O) (densidad de color rojo) con la región alrededor del sitio de unión a tetraciclina primaria. Hélices 31, 34 y 44 se representan como en el panel A. Las bases que experimentan cambios en la accesibilidad DMS sobre la tetraciclina (U1052 y C1054, verde), EF-G (A1408, naranja C1400, rosa), o Tet (O) ( C1214, A1408 azul, naranja) la unión se dibujan en una bola y palo representación. Esta cifra se ha reproducido de la referencia 12 con permiso del editor. mecanismo propuesto de Tet (O) mediada por la resistencia a la tetraciclina. Un modelo que describe Tet (O) mediada por la resistencia a la tetraciclina (Fig. 1. Reacciones F hasta J) fue presentado por Spahn et al. (45) y resume la mayoría del trabajo bioquímico y estructural hecho en Tet (O) y Tet (M). En ausencia de tetraciclina, del ribosoma 70S progresa a través de los diferentes estados del ciclo de elongación (Fig. 1. Reacciones A a E) (véase la leyenda de la figura para obtener una descripción detallada). En presencia de tetraciclina, sin embargo, la progresión ordenada de que el ciclo de elongación se interrumpe y el ribosoma se bloquea en un estado posttranslocational porque subsiguiente Una ocupación sitio se inhibe. Aunque este bloqueo es probablemente debido a un choque estérico directo entre la tetraciclina y el entrante aa-tRNA, es posible que la unión de la tetraciclina al ribosoma (reacción f) se acompaña de una reorganización estructural. Aunque un cambio conformacional bruto no se observa en la estructura cristalina de la tetraciclina unido a la subunidad 30S (4. 37), un cambio conformacional puede deducirse de varios experimentos bioquímicos (11. 14. 32. 56). Por ejemplo, Noé et al. (32) presentaron pruebas de que la tetraciclina afecta h44. Observaron que un reticular UV-dependiente entre c1402 y C1501, dos bases situadas en la parte superior de h44, se ve reforzada por la presencia de tetraciclina. Estas bases son distintos de los sitios de unión de tetraciclina observados y pueden indicar que la tetraciclina está promoviendo reorganización estructural sutil o la fijación de los ribosomas en una conformación que es favorable para el establecimiento de la reticular c1402-C1501. La naturaleza y el papel de este cambio conformacional propuesta no se conoce, sin embargo, el cambio podría simplemente mover el ribosoma en una configuración compatible con la unión estable de tetraciclina. Adicionalmente, como h44 es un componente del sitio de decodificación, puede tener un papel en la acción inhibidora de la tetraciclina. Sin embargo, los modelos presentados en los documentos de Brodersen et al. y Pioletti et al. (4. 37) sugieren que la tetraciclina se ejerce afecta simplemente a través de un choque estérico con un ARNt acomodar tal que su unión es bloqueado, lo que presumiblemente hace un cambio conformacional innecesaria. En cualquier caso, la unión al ribosoma tetraciclina presumiblemente no interfiere con la decodificación inicial y actividad GTPasa EF-Tu-dependiente, sino más bien evita la ocupación estable de la A-sitio por entrante aa-tRNA (4), un paso que se denomina alojamiento. Esto puede bloquear el ribosoma en un ciclo no productiva de la liberación de la unión y complejo ternario (Fig. 1. Reacciones i y j) (4). En presencia de tet (O), este ciclo no productiva se evitaría, como Tet (O) se uniría el ribosoma tetraciclina bloqueado, suelte la tetraciclina, y devolver el ribosoma para el ciclo de alargamiento (Fig. 1. Reacciones g y h) . El mecanismo por el cual Tet (O) distingue al ribosoma tetraciclina bloqueado no ha sido establecida, pero le sugerimos que podría implicar dos mecanismos. En primer lugar, un cambio conformacional inducido por tetraciclina en el ribosoma puede promover Tet (O) de unión (11). En segundo lugar, los bloques de tetraciclina al ribosoma en un estado con un sitio abierto, y un ribosoma en esta condición parece ser el sustrato preferido para Tet (O) porque Tet (O) no puede obligar a un ribosoma con un ocupado un sitio (11). En presencia de tetraciclina, el ribosoma es bloqueado con un sitio abierto y esto podría proporcionar una ventana cinética para Tet (O) para actuar, distinguiendo así el ribosoma tetraciclina bloqueado de un ribosoma de traslación (11). Después de Tet (O) se ha unido al ribosoma tetraciclina bloqueado, tiene que liberar el ribosoma de la tetraciclina (Fig. 1. reacción g). Trieber et al. (54) demostraron que la unión de Tet (O) en el estado GTP es suficiente para desencadenar la liberación de tetraciclina, mientras que DMS-sondeo experimentos mostraron que Tet (O) desencadena específicamente la liberación de la tetraciclina del sitio de unión de tetraciclina primario (12 ). Además, los estudios crio-EM demostraron que cuando Tet (O) se une al ribosoma, no se solapa directamente el sitio de unión de tetraciclina primario, y por lo tanto, Spahn et al. (45) propusieron que Tet (O) provoca la liberación de tetraciclina a través de un mecanismo alostérico. Cabe señalar, sin embargo, que una interacción directa entre Tet (O) y la tetraciclina unido al sitio primario no se puede descartar del todo, aunque tanto química sondaje y crio-EM sugiere esto no es el caso (12. 45). El cambio conformacional propuesta resulta en la liberación de tetraciclina probablemente se debe a H34 como (i) h34 forma parte integrante del sitio de unión primaria tetraciclina (4. 37), (ii) reconstrucciones crio-EM demuestran que el dominio IV del Tet contactos (O) las de base de h34 (45), y (iii) Tet (O) protege C1214 en la base de h34 de modificación química por DMS (12). Como tal, Spahn et al. (45) la hipótesis de que, tras la unión, Tet (O) contacto con la base de h34, que a su vez causa una perturbación en esta hélice, que se propaga en el sitio primario de unión a tetraciclina, la liberación de la droga. Además del cambio conformacional se propone en h34 que resulta en la liberación de tetraciclina, tet (O) invoca reordenamientos estructurales en H44 (12), un sitio distinto tanto del sitio de unión a tetraciclina primaria (4. 37) y el Tet (O) de unión sitio observado en la reconstrucción crio-EM (45). Las razones de este largo alcance reordenación no se entienden todavía, pero los siguientes puntos deben ser considerados: (i) Tet (O) se pueden revertir un reordenamiento inducido por tetraciclinas h44 (discutido anteriormente), (ii) el efecto sobre h44 puede ser una consecuencia de Tet (O) que se deriva de EF-G y no puede estar relacionada con Tet (O) actividad (12), y (iii) Tet (O) pueden inducir una conformación alterada en el ribosoma para evitar reconsolidación tetraciclina y / o promover la unión complejo ternario (11). Con respecto al último punto, el hecho de que Tet (O) puede estimular la actividad GTPasa de EF-Tu sugiere que Tet (O) puede inducir cambios conformacionales en el ribosoma que persisten después de que se ha disociado (11). Sin embargo, después de la eliminación de tetraciclina del ribosoma, Tet (O) debe disociarse de los ribosomas (Fig. 1. La reacción h) para que el complejo ternario (EF-Tu-aa-tRNA-GTP) se puede unir y la síntesis de proteínas puede continuar ( Fig. 1. reacciones a a e). OBSERVACIONES FINALES La investigación en los últimos años ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la actividad RPP. Por ejemplo, los estudios estructurales en el ribosoma (3. 24. 43. 58) y el complejo ribosoma-tetraciclina (4. 37) han ampliado en gran medida nuestra comprensión de la síntesis de proteínas y el mecanismo molecular de acción de tetraciclina. Cuando la bioquímica (11. 12. 15) y estructural se combinan (45) los datos que describen el sitio de unión ribosomal PRP, la interacción de la RPP con el ribosoma se puede modelar con alta precisión (Tabla 1). Además, la combinación de estos datos ha proporcionado un mecanismo plausible que explica el modo de acción RPP en detalle molecular, a saber, que los RPPs interactúan con la base de h34, resultando en una alteración alostérica de la unión y por lo tanto liberar el fármaco de tetraciclina primario (45 ). Un aspecto desconcertante de resistencia a la tetraciclina mediada por RPP que sigue sin respuesta es la cuestión de si o no el PRP funciona activamente para prevenir reconsolidación tetraciclina después de activarse la liberación de tetraciclina. Esta es una pregunta importante porque, después de ser liberado, la tetraciclina es libre de volver a vincular el ribosoma y otra vez inhibe la síntesis de proteínas. En este sentido, si un mecanismo activo no existe, Tet (O) puede ser necesario para trabajar sucesivamente antes de un aa-tRNA compite exitosamente con tetraciclina para el sitio. Alternativamente, una posibilidad atractiva es que Tet (O) puede promover reordenamientos sutiles en la arquitectura ribosomal que lento reconsolidación tetraciclina y mejorar activamente la capacidad del complejo-tRNA aa para unirse al sitio. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a Daniel Wilson para la lectura crítica del manuscrito y James Gunton en busca de ayuda durante la preparación del manuscrito. Este trabajo fue financiado por la Alberta Heritage Foundation para la Investigación Médica (AHFMR) a través de una Beca de AHFMR S. R.C. y D. M.T, un Premio Científico AHFMR a D. E.T. una beca del Consejo Nacional de Ciencia e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) a D. E.T. y una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a K. H.N. (Ni174 / 8-3). NOTAS Autor correspondiente. Dirección postal: Departamento de Microbiología Médica Inmunología, 1-28 Edificio de Ciencias Médicas, Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta T6G 2H7, Canadá. Teléfono: (780) 492-4777. Fax: (780) 492-7521. E-mail: ualberta. ca diane. taylor. Dirección actual: Institut fr Medizinishe Physik und Biophysik, Universittsklinikum Charité, 10117 Berlín, Alemania. Referencias Agrawal, R. K. A. B. Heagle, P. Penczek, R. A. Grassucci, y J. Frank. la hidrólisis de GTP 1999. EF-G-dependiente induce la translocación acompañado de grandes cambios conformacionales en el ribosoma 70S. Nat. Struct. Biol. 6: 643 -647. Agrawal, R. K. C. M. Spahn, P. Penczek, R. A. Grassucci, K. H. Nierhaus, y J. Frank. 2000. La visualización de los movimientos de ARNt en las coli 70S del ribosoma de Escherichia durante el ciclo de elongación. J. Cell Biol. 150: 447 -460. Ban, N. P. Nissen, J. Hansen, P. B. Moore, y T. A. Steitz. 2000. La estructura atómica completa de la subunidad ribosómica grande en 2,4 resolución. Ciencia 289: 905 -920. Brodersen, D. E. W. M. Clemons, A. P. Carter, R. J. Morgan-Warren, B. T. Wimberly, y V. Ramakrishnan. 2000. La base estructural para la acción de la tetraciclina antibióticos, pactamycin, y la higromicina B en la subunidad ribosomal 30S. Cell 103: 1143 -1154. Burdett, V. 1991. Purificación y caracterización de Tet (M), una proteína que hace que los ribosomas resistentes a la tetraciclina. J. Biol. Chem. 266: 2872 -2877. Burdett, V. 1996. Tet (M) de liberación de tetraciclina - promoted de los ribosomas es dependiente de GTP. J. Bacteriol. 178: 3246 -3251. Cameron, D. M. J. Thompson, P. E. marzo, y A. E. Dahlberg. 2002. factor de iniciación IF2, tioestreptona y micrococcin prevenir la unión del factor de elongación G al ribosoma de Escherichia coli. J. Mol. Biol. 319: 27 -35. Chopra, I. 1985. Modo de acción de las tetraciclinas y la naturaleza de la resistencia bacteriana a ellos, p. 317 -392. En J. H. Boothe y J. J. Hlávka (ed.), Las tetraciclinas (recopilación de la farmacología experimental), vol. 78. Springer-Verlag, Berlín, Alemania. Chopra, I. 1994. La tetraciclina análogos cuyo objetivo principal no es el ribosoma bacteriano. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 637 -640. Chopra, I. y M. Roberts. 2001. Los antibióticos de tetraciclina: modo de acción, las aplicaciones, la biología molecular y la epidemiología de la resistencia bacteriana. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 232 -260. Connell, S. R. C. A. Trieber, E. Einfeldt, G. P. Dinos, D. E. Taylor, y K. Nierhaus. 2003. Mecanismo de Tet (O) mediada por la resistencia a la tetraciclina. EMBO J. 22: 945 -953. Connell, S. R. C. A. Trieber, U. Stelzl, E. Einfeldt, D. E. Taylor, H. y K. Nierhaus. 2002. La proteína de resistencia a tetraciclina, tet (O), perturba la conformación del centro de decodificación ribosomal. Mol. Microbiol. 45: 1463 -1472. Cundliffe, E. 1967. Los antibióticos y polirribosomas. Clortetraciclina y polirribosomas de Bacillus megaterium. Mol. Pharmacol. 3: 401 -411. Dahlberg, A. E. E. Lund, N. O. Kjeldgaard, C. M. Bowman, y M. Nomura. 1973. Colicina E3 escisión inducida del 16S ribosomal bloquean el ácido ribonucleico efectos de ciertos antibióticos. Bioquímica 12: 948 -950. Dantley, K. A. H. K. Dannelly, y V. Burdett. 1998. interacción de unión entre Tet (M) y el ribosoma: requisitos para la unión. J. Bacteriol. 180: 4089 -4092. Doyle, D. J. K. McDowall, M. J. Butler, e I. S. Hunter. 1991. Caracterización de un gen de oxitetraciclina-resistencia, otra, de Streptomyces rimosus. Mol. Microbiol. 5: 2923 -2933. Epe, B. y P. Woolley. 1984. La unión de 6-demethylchlortetracycline al 70S, 50S y 30S ribosomal partículas: un estudio cuantitativo por anisotropía de fluorescencia. EMBO J. 3: 121 -126. Frank, J. 2001. crio-microscopía electrónica como herramienta de investigación: el ribosoma como un ejemplo. BioEssays 23: 725 -732. Gerrits, M. M. M. R. De Zoete, N. L. Arents, E. J. Kuipers, y J. G. Kusters. 2002. 16S rRNA mutación mediada por resistencia a la tetraciclina en Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 2996 -3000. J. Biol. Chem. Antimicrob. Proc. Natl. Acad. Sci. J. Biol. Chem. Nucleic Acids Res. Antimicrob. Antimicrob. Antimicrob. Antimicrob. Nucleic Acids Res. FEMS Microbiol. Letón. Mol. Mol. Biochem. Biophys. Res. Commun. Antimicrob. Antimicrob. Chem. Sociedad Americana de Microbiología